microRNA实时定量PCR-康成生物丨数谱生物

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        microRNA实时定量PCR

        • 简介
        • 实验流程
        • 客户案例
        •        实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂,利用荧光信号实时检测PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。成熟microRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA,由于长度太短,不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物,配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平,也可以用终点PCR法定性检测。

          Aksomics(康成生物)为您提供microRNA实时定量PCR技术6282018.cc威尼斯网址,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术6282018.cc威尼斯网址人员就可替您完成microRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。

        • 1. 引物设计、合成

                 设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针,并合成该microRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
          2. 样品RNA抽提
                 a.组织样品:取适量(50~100mg)新鲜组织或正确保存的组织样品,匀浆后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
                 b.细胞样品:取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,吸去PBS后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
          3. RNA质量检测
                 a.紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值,获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。

                 b.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
                 注:用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品,必须高纯度、完整,没有RNase污染(降解的样品不能用于实时定量PCR检测),同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
          4. 逆转录合成cDNA    

                 利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
          5. 实时定量PCR
                 以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增,梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增,根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参,校正上样误差。
          6. 分析结果、提供实验报告
                 分析实时定量PCR结果,根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告,包括详细的实验方法,实时定量PCR实验数据和图表。



        • Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Circulation, 2011.
                 研究者首先采用Exiqon miRCURY LNA™芯片(v11.0)检测13例高血压患者和5例健康人血浆样本的microRNA表达谱,发现27个表达差异的microRNA。随后对第二组24例高血压患者和22例健康人的血浆样本,应用实时定量PCR方法对芯片筛选出的表达有变化的microRNA进行验证(见下图)。PCR结果和芯片结果一致。并进一步在第三组,194例高血压患者和97例健康人的血浆样本中应用实时定量PCR方法对挑选出的重要microRNA进行检测。发现与健康人相比,HCMV编码的hcmv-miR-UL112在高血压患者的血浆中表达明显上调。

          上图:microRNA qPCR验证microRNA芯片数据。从microRNA芯片数据挑选了20个差异表达的microRNA,利用荧光定量PCR进行验证,结果显示与microRNA芯片得出的表达趋势基本一致。红色表示健康人样本,绿色表示高血压病人样本,microRNA的表达量经过snRNA U6归一化。


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